| # | 来源 | 链 | 位置 | PAM/PFS | 优先级 | guide (5'→3') | 长度 | GC% | 标记 |
|---|
| 场景 | 酶 | PAM优选 | 长度 | GC |
|---|---|---|---|---|
| Cas12a常规诊断 | Cas12a | TTTV | 23 nt | 40–65% |
| Cas12b一管法（配LAMP） | Cas12b | TTN | 23 nt | 40–65% |
| Cas13a RNA直检 | Cas13 | PFS 3' 非G | 28 nt | 40–60% |
| Cas14 / 无PAM位点 | 无PAM | — | 23 nt | 40–65% |
① 跨物种BLAST：NCBI BLAST ↗
—— 候选guide ≥17/23命中非靶标即判非特异；若≥17/23但种子区（PAM近端8–10 nt）错配 ≥3，实际脱靶风险低，归为「准特异」。
② 种子区排他：在多重体系里，crRNA的种子区必须对所有其他扩增子错配 ≥2（硬约束）。
本工具不做以上两步，也不做任何活性预测——请把它当作「按规则缩短候选清单」的工具，而不是「选出来就能用」的工具。