2. 与CRISPR联用的恒温扩增技术（共享版）

第1页 可以和CRISPR联用的恒温扩增技术 王金 wangjin@tolobio.com 吐露港生物 第2页 •LAMP/CPA •RPA/RAA/ERA •NASBA/TMA/SAT •RCA •SDA/HAD •EXPAR •HCR •…… 常用的恒温扩增技术列表 第3页 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) Notomietal.,NAR.2000,28(12):363 第4页 https://lamp.neb.com/#!/ LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) 第5页 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) •可关注浑浊度（焦磷酸镁）/颜色； •可关注荧光（SYTO-9,SYBRGI等）； •可结合探针设计（RNaseH2）； F Q 第6页 •CPA（Cross Priming Amplification ），优思达2012年开发（Sci Rep.2012:2:246.doi: 10.1038/srep00246.Epub2012 Feb 3.） •SEA (strand exchange amplification)，2016年青岛科技大学团队开发 (Chemical CommunicationsVolume52, Issue 77,11551 –11554,2016) LAMP类似体系 第7页 •CRISPR-Cas12b一步法体系有不同叫法：最早的叫HOLMESv2,也有叫 CDetection/STOPcovid（针对新冠检测）；可利用CRISPR的高特异性优点 来克服LAMP的非特异性扩增。 •Cas12b推荐ToloBioAapCas12b(#32118)，也可以使用AacCas12b （#32116） •Reporter探针推荐ToloBio31101 HOLMES-FluossDNA reporter (FAM) •体系建立的流程：（1）先摸索LAMP效率，可以用SYTO-9染料或者SYBRGI 染料；（2）在建立了LAMP体系的基础上，进一步筛选Cas12bsgRNA。注意 应设计在扩增子序列上，避开与引物直接互补配对。同时，应该考虑到PAM序 列，以及sgRNA活性对一步法灵敏度的影响。 LAMP+Cas12b,一步法体系：高特异，点突变 第8页 RPA(Recombinase polymerase amplification) •TwistDxInc.wasfoundedin1999bymolecularbiologistandproteinbiochemist,DrNiallArmes, togetherwithDrDerekStempleandDrNageshMahanthappawithitsheadquartersinCambridge, Massachusetts,USA. •TwistDx™Limitedwasformedin2002. •21Feb2002ASM SCIENTIFIC, INC.（TwistDx前身） •07 Mar 2012ALERE SAN DIEGO, INC. •30Jan2016,ALEREacquiredbyABBOTT(53亿美元） •11Apr2025,EXPIRE 第9页 RPA及类似技术 •RPA：TwistDx,ThermoFisher,Tolo •RAA：recombinase-aided amplification （河北农业大学程奇教授；江苏奇天；杭州众测） •MIRA：Multienzyme Isothermal Rapid Amplification （安普未来） •ERA：Enzymatic Rapid Amplification（先达 基因） SSB Bsu 第10页 RPA探针设计原理 第11页 RPA与CRISPR结合：提升特异性，实现点突变检测 Nat. Commun.,2020 ToloBio RPA LbCas12a AapCas12b AacCas12b 第12页 TMA/NASBA/SAT •Nucleic Acid Sequenced Based Amplification(NASBA,Cangene,1991); •TranscriptionMediatedAmplification (TMA,Gen-Probe,1995,HOLOGIC前身); •NASBA需要另加RNaseH •TMA用的是野生型RT，有RNaseH活性 •SAT:Simultaneous Amplification and Testing；含有MBprobe NEB 第13页 RCA(Rolling Circle Amplification) 第14页 SDA(Strand Displacement Amplification) （摘自NEB官网） 切刻内切酶扩增反应（NEAR）, 与SDA类似 第15页 HDA(Helicase-Dependent Amplification) (EMBO reports (2004) 5, 795–800. doi:10.1038/sj.embor .7400200) 第16页 EXPAR(exponential amplification reaction ) (Proc Natl AcadSci USA. 2003 Apr 15;100(8):4504-9) 第17页 HCR(Hybridization Chain Reaction) (Proc Natl AcadSci USA.2004 Oct 26;101(43):15275-8.) 第18页 摘自ThermoFisher官网 第19页 第20页 CRISPR新品预报 1.CRISPRreporter探针（适合CRISPR诊断多重）； 2.多款CRISPRCas蛋白，高特异，高性能Cas12/Cas13； 3.…… 第21页 To l o B i o荧光探针选购指南 HOLMES-Fluo ssDNA reporters HOLMES-Fluo ssRNA reporters reporter 1 #31101 reporter 2 #31102 reporter 3 #31103 reporter 4 #31104 reporter 1 #31111 reporter 2 #31112 reporter 3 #31113 reporter 4 #31114 reporter 5 #31115 reporter 6 #31116 LbCas12a (High Conc.) #32108 +++++ +++++ +++++ +++++ +++++ +++ +++ +/– — +/– LbCas12a (Low Conc.) #32108 +++++ ++++ +++++ ++++ +++ ++ +/– — — — Lb5Cas12a (High Conc.) #32110 +++++ +++++ +++++ ++++ ++++ ++ + — — — Lb5Cas12a (Low Conc.) #32110 +++++ ++++ ++++ ++ ++ +/– — — — — FnCas12a (High Conc.) #32106 +++++ +++++ ++++ +++ +++ +++ +/– — — — FnCas12a (Low Conc.) #32106 +++++ ++++ +++ + + + — — — — AsCas12a (High Conc.) #32104 +++++ +++++ +++++ +++++ ++++ ++++ +++ +/– — + AsCas12a（LowConc.） #32104 ++++ +++ ++++ ++++ ++ ++ +/– — — +/– AapCas12b (High Conc.) #32118 +++ +++ + + + ++ +/– — — +/– AacCas12b (High Conc.) #32116 ++ ++ + + + + — — — — Un1Cas12f1 (Cas14a) (High Conc.) #32119 +++ +++ ++ ++ ++ + — + — — LwaCas13a (High Conc.) #32117 — — — — +++++ +++++ +++++ +++++ ++ +++ LwaCas13a (Low Conc.) #32117 — — — — ++++ ++++ ++++ + + + LbuCas13a (High Conc.) #32134 — — — — +++++ +++++ +++++ +++++ +++++ +++++ LbuCas13a (Low Conc.) #32134 — — — — ++++ +++ ++++ + + +++ 备注：High Conc.含100 nM Cas蛋白，25 nM靶标核酸；Low Conc.含10 nM Cas蛋白，2.5 nM靶标核酸；+数量与剪切效率正相关；+/–表示剪切效率极低；–表示无剪切； 第22页 •50度，酶/Buffer分开 •通用型 •5-15min •1-6片段（基础款） •37度，2xMix通用型 •5-15min •1-15片段 •50度，2xMix通用型 •5-15min •1-15片段 •60度，2xMix通用型 •1min •1-15片段 ToloEzMax无缝拼接（无缝克隆）试剂盒 #24303 #24305 #24317 #24321 第23页 •克隆：1min同源重组反应#24321 •转化：45S热激 •涂板：免复苏 Tolo开启5min克隆时代！ 第24页 关注我们， 了解更多进展！ ToloBio微信公众号 添加技术支持， 加入交流群！ 加入本群，交流 CRISPR诊断技术！ FightGlobalHealthThreatbyCutting-edgeCRISPRTe c h n o l o g i e s ! 基于CRISPR创新科技，解决全球健康威胁！ 上海|无锡