CRISPR诊断技术的研究进展及应用展望（12.21复旦）

第1页 CRISPR诊断技术的研究进展 及应用展望 王金 wangjin@tolobio.com 吐露港生物 2025.12.21 复旦.上海 第三期“CRISPR诊断技术创新与转化”专题会 第2页 CRISPR-Dx核心原理：基于Cas蛋白反式切割 待检靶标:DNA/RNA 向导RNA Cas蛋白:Cas12/Cas13 第3页 Liet al.,TrendsBiotech,2022 CRISPR-Dx体系的反应条件简单，检测手段灵活 第4页 Liet al.,TrendsBiotech,2022 CRISPR-Dx体系的反应条件简单，检测手段灵活 灵敏 特异 简便 o单分子 o假阴性低 o病原检测 oSNP o假阳性低 o肿瘤/耐药/遗传病 o恒温反应 o仪器依赖低 o家庭自测 第5页 CRISPR诊断技术成熟曲线 CRISPR-Dxishere! 第6页 CRISPR-Dx的关键技术难题…… CRISPR-Dx体系 （SHERLOCK/HOLMES/D ETECTR） 第7页 CRISPR-Dx的关键技术难题…… CRISPR-Dx体系 （SHERLOCK/HOLMES/D ETECTR） One-pot体系（RPA+Cas12a/LAMP +Cas12b/RPA+Cas12 b/Cas13……) 第8页 CRISPR-Dx的关键技术难题…… CRISPR-Dx体系 （SHERLOCK/HOLMES/D ETECTR） One-pot体系（RPA+Cas12a/LAMP +Cas12b/RPA+Cas12 b/Cas13……) PAM-free（Cas突变体、生成 ssDNA……) 第9页 CRISPR-Dx的关键技术难题…… CRISPR-Dx体系 （SHERLOCK/HOLMES/D ETECTR） One-pot体系（RPA+Cas12a/LAMP +Cas12b/RPA+Cas12 b/Cas13……) 一管多重体系（Cas12+Cas13……) PAM-free（Cas突变体、生成 ssDNA……) 第10页 CRISPR-Dx的关键技术难题…… CRISPR-Dx体系 （SHERLOCK/HOLMES/D ETECTR） One-pot体系（RPA+Cas12a/LAMP +Cas12b/RPA+Cas12 b/Cas13……) 一管多重体系（Cas12+Cas13……) 绝对（相对）定量（类似dPCR的技术平台……) PAM-free（Cas突变体、生成 ssDNA……) 第11页 CRISPR-Dx的关键技术难题…… CRISPR-Dx体系 （SHERLOCK/HOLMES/D ETECTR） One-pot体系（RPA+Cas12a/LAMP +Cas12b/RPA+Cas12 b/Cas13……) 一管多重体系（Cas12+Cas13……) 免扩增直检（Cascade、微体积、 电化学、多crRNA……) 绝对（相对）定量（类似dPCR的技术平台……) PAM-free（Cas突变体、生成 ssDNA……) 第12页 CRISPR-Dx的关键技术难题…… CRISPR-Dx体系 （SHERLOCK/HOLMES/D ETECTR） One-pot体系（RPA+Cas12a/LAMP +Cas12b/RPA+Cas12 b/Cas13……) 一管多重体系（Cas12+Cas13……) 免扩增直检（Cascade、微体积、 电化学、多crRNA……) 绝对（相对）定量（类似dPCR的技术平台……) PAM-free（Cas突变体、生成 ssDNA……) CRISPR仪器（POCT、自测……) 第13页 CRISPR-Dx的关键技术难题…… CRISPR-Dx体系 （SHERLOCK/HOLMES/D ETECTR） One-pot体系（RPA+Cas12a/LAMP +Cas12b/RPA+Cas12 b/Cas13……) 一管多重体系（Cas12+Cas13……) 免扩增直检（Cascade、微体积、 电化学、多crRNA……) 绝对（相对）定量（类似dPCR的技术平台……) PAM-free（Cas突变体、生成 ssDNA……) CRISPR仪器（POCT、自测……) 非核酸检测（Cas12+Cas13……) 第14页 CRISPR-Dx的关键技术难题…… CRISPR-Dx体系 （SHERLOCK/HOLMES/D ETECTR） One-pot体系（RPA+Cas12a/LAMP +Cas12b/RPA+Cas12 b/Cas13……) 一管多重体系（Cas12+Cas13……) 免扩增直检（Cascade、微体积、 电化学、多crRNA……) 绝对（相对）定量（类似dPCR的技术平台……) PAM-free（Cas突变体、生成 ssDNA……) CRISPR仪器（POCT、自测……) 标准化（Cas酶、体系、设备、 判读方法……) 非核酸检测（Cas12+Cas13……) 第15页 一管法/一锅法/一步法的定义 one-tube/一管法 one-pot/一锅法 one-step/一步法 （可以物理分隔） （可以两步反应） （需满足一管、一锅、一步反应） 第16页 CRISPR非核酸检测值得关注：便捷、高敏、不怕气溶胶污染！ Zhanget al.,TrendsBiotech,2025 第17页 CRISPR诊断结果的判读标准：荧光、胶体金、电化学、显色？ qPCR——Ctvalue LAMP/RPA——Ttvalue CRISPR+LAMP/RPA——Ttvalue •endpointvalue终点法 •FC •ratio •FCration(SENA) •Ct(CRISPR-TB) •是否可以用Atvalue(angle)？ 阴性At=0；最高值At=90 •肉眼观察 •如何定量？ 第18页 CRISPR体系的标准化 第一款CRISPREUA的体系 现有的科研论文（诊断产品），都是用Cas蛋 白的浓度单位：ng或pmol，而不是活力单位。 浓度单位会造成不同体系之间的结果不可重 复，同一体系也会因为使用不同批次/不同厂 家的酶而导致不稳定，或实验结果不可重复。 第19页 CRISPR体系的标准化 现有的科研论文（诊断产品），都是用Cas蛋 白的浓度单位：ng或pmol，而不是活力单位。 浓度单位会造成不同体系之间的结果不可重 复，同一体系也会因为使用不同批次/不同厂 家的酶而导致不稳定，或实验结果不可重复。 第一款CRISPREUA的体系 Tolo提供标准化Cas酶 1CastransU=37°C、1分钟内切割1 pmol探针的酶量 第20页 为什么CRISPR是下一代诊断技术? 第21页 (1983PCR-1993qPCR) PCR（灵敏、精准） (1990sMPSS-2004SBS) NGS（通量、成本） (2016trans-cleavage-) CRISPR（简便、快速） M-Dx：从PCR到CRISPR，分别解决了不同的痛点！ 第22页 1.CRISPR的主战场将在自测的场景：非专业人士、便携式检测，包括人 和非人的应用。但是，核酸自测需解决气溶胶污染的问题； 2.CRISPR核酸检测，基于其高特异性的优点，可以在临床应用中提升特 定项目的检测灵敏度（病原体检测、肿瘤筛查……）； 3.CRISPR非核酸的应用潜力将不亚于核酸检测项目，CRISPR-Dx的高敏 和便捷优点，将成为现有免疫技术的有力竞争者； 4.CRISPR免扩增直检核酸的技术成熟之后，将会在临床和自测项目引发 革命性的变化！ CRISPR-Dx技术的潜在应用场景 第23页 我们通过现代化办公的演变史 来预测 CRISPR分子自测的发展前景 第24页 台式机 笔记本 服务器 智能手机 从台式机到智能手机：在满足性能需求的同时，变的更便捷 第25页 台式电脑： •实现数字化 •需固定场所 第26页 笔记本： •移动/使用方便 第27页 服务器： •处理大量数据 第28页 智能手机： •实现移动互联 第29页 M-Dx领域有类似趋势？ 第30页 台式机 PCR PCR •开启MDx时代 •需分区实验室 台式电脑 •实现数字化 •需固定场所 第31页 台式机 笔记本 PCR POCT 笔记本 •使用更方便 POCT •使用更方便 第32页 台式机 笔记本 服务器 PCR POCT NGS 服务器 •大数据 NGS •大样本 第33页 台式机 笔记本 服务器 智能手机 PCR POCT NGS CRISPR 智能手机 •实现移动互联 CRISPR •实现个人自测(随时、随地、任何人) 第34页 台式机 （笔记本） 服务器 智能手机 PCR （POCT） NGS CRISPR 第35页 一款基于CRISPR的居家自测产品： 安全、简单、便捷、便宜、精准 •试纸条 •小仪器 •方便携带 •<20min •¥ 10-20 •$10-20 •核酸自测 •等温扩增+CRISPR（特异、灵敏） •COMPASS（防气溶胶污染） •使用安全 •环境安全 第36页 吐露港生物（ToloBio）简介 第37页 v拥有下一代CRISPR诊断领域的全球底层专利 v开展广泛专利授权，共建CRISPR诊断产业生态 v提供CRISPR分子诊断的核心原料和整体解决方案 v在无锡惠山有IVD研发、质检实验室和GMP生产场地 赵国屏 联合创始人 •中国科学院院士、发展 中国家科学院院士 •香港中文大学医学院教 授、中国科学院深圳先 进技术研究院合成生物 学研究所首席科学家 王金 董事长/总经理/联合 创始人 •中国科学院上海生命 科学研究院博士 •国家自然科学基金优 秀青年基金获得者 •HOLMES专利发明人 吐露港公司：基于CRISPR创新科技，解决全球健康威胁！ 第38页 底层专利授权 产品开发生产 •Cas12和Cas13诊断中国独占权 •蛋白+方法学底层专利 •产品开发迭代及生产能力 •成熟车间及产能配备 … … … … 分子诊断试剂盒产品提供商 医院 社区 家庭 多场景分子诊断应用 国产产品出海 产品海外销售 •全球范围内与Sherlock共享 Cas12和Cas13专利 •搭建海外销售渠 •选择优质产品出海 海外：提前搭建销售渠道，推动中国智造产品出海 优质CRISPR诊断产品 国内：专利授权+CDMO扩展应用，做大市场 平台型专利，通过授权打造CRISPR产业生态 国内优质产品出海+海外优秀产品引进 >99.9%应用场景对外授权 ToloBio坚持做CRISPR诊断的“港湾”，为授权合作伙伴赋能！ 第39页 吐露港公司推动CRISPR-Cas蛋白的标准化 全系列Cas酶原料 第40页 CRISPR配套分子酶 第41页 •50度，酶/Buffer分开 •通用型 •5-15min •1-6片段（基础款） •37度，2xMix通用型 •5-15min •1-15片段 •50度，2xMix通用型 •5-15min •1-15片段 •60度，2xMix通用型 •1min •1-15片段 ToloEzMax无缝拼接（无缝克隆）试剂盒 #24303 #24305 #24317 #24321 第42页 •克隆：1min同源重组反应#24321 •转化：45S热激 •涂板：免复苏 Tolo开启5min克隆时代！ 第43页 关注我们， 了解更多！ ToloBio微信公众号 FightGlobalHealthThreatbyCutting-edgeCRISPRTe c h n o l o g i e s ! 基于CRISPR创新科技，解决全球健康威胁！ 上海|无锡