CRISPR-Cas系统核酸检测原理

第1页 CRISPR/Cas系统核酸检测原理 王金 wangjin@tolobio.com 吐露港生物 2026.09.11 吐露港内部培训 第2页 CRISPR技术获得2020诺贝尔奖 Top 10 Breakthrough of the year 2013, 2015, 2017 by Science “基因魔剪、上帝的手术刀” 第3页 CRISPR诊断技术的核心方法学原理 待检靶标: DNA / RNA 向导RNA CRISPR-Cas蛋白: Cas12 / Cas13 反式切割活性/旁路切割活性：靶标存在，切割探针，释放信号！ 第4页 CRISPR诊断技术的核心方法学原理 待检靶标: DNA / RNA 向导RNA CRISPR-Cas蛋白: Cas12 / Cas13 反式切割活性/旁路切割活性：靶标存在，切割探针，释放信号！ 第5页 Li et al., Trends Biotech, 2022 CRISPR诊断方法的检测手段非常灵活 第6页 CRISPR诊断技术的核心方法学路径 Methods, 2022 /DETECTR 第7页 CRISPR诊断技术的核心方法学路径 Methods, 2022 /DETECTR HOLMES: 2017.07.14; DETECTR: 2017.11.22 第8页 CRISPR诊断技术成熟曲线 CRISPR-Dx is here! 第9页 CRISPR-Dx的关键技术难题…… CRISPR-Dx体系（SHERLOCK/HOLMES/DETECTR） One-pot体系（RPA+Cas12a/LAMP+Cas12b/RPA+Cas12b/Cas13……) 一管多重体系（Cas12+Cas13……) 免扩增直检（ Cascade、微体积、电化学、多crRNA……) 绝对（相对）定量（类似dPCR的技术平台……) PAM-free（Cas突变体、生成ssDNA……) CRISPR仪器（POCT、自测……) 标准化（Cas酶、体系、设备、判读方法……) 非核酸检测（Cas12+Cas13……) 第10页 一管法/一锅法/一步法的定义 one-tube/一管法 one-pot/一锅法 one-step/一步法 （可以物理分隔） （可以两步反应） （需满足一管、一锅、一步反应） 第11页 Li et al., ACS Synth Biol., 2019 N Engl J Med, 2020 基于CRISPR-Cas12的一步法检测 Nat. Commun., 2020 第12页 CRISPR-Dx一管法技术面临的挑战及应对策略 次优PAM crRNA blocker 温度调控Cas12b活性 突变体Cas12b CRISPR-Dx一管法检测中等温扩增和Cas顺式切割相互竞争 次优PAM以及突变体Cas12b的使用可能降低其自身灵敏度 Cas12b在较低温度下（如RPA反应）依旧有一定的顺式切割活性 扩增和检测之间打架：影响检测灵敏度！ 不彻底 不便宜 第13页 TRACE：Thermally regulated asynchronous CRISPR-enhanced one-pot assay 第14页 GenLink（精灵）提供便携式TRACE解决方案 便携式检测设备可与手机进行蓝牙连接，实时观测检测结果 便携式检测设备与qPCR检测性能基本一致 对23份临床样本的检测结果基本与qPCR一致 (Nature Communications, accepted) 第15页 摘自ThermoFisher官网 第16页 CRISPR-Cas12结合PCR：提高特异性和灵敏度 (Huang, et al., EBioMedicine, 2020) 第17页 (The Lancet Microbe, 2022; Front Immunol, 2023) CRISPR-Cas12结合PCR：cfDNA的高灵敏检测 第18页 COMMUNICATIONS BIOLOGY, 2021, 4: 476 ACS Nano 2021, 15 (1): 1167-1178 Nano Lett. 2021, 21: 4643−4653 Anal. Chem. 2022, 94(15): 5883–5892 ToloBio (ZL201810560284.8) 基于微反应体系的CRISPR-Cas12绝对定量 第19页 Ackerman et al., Nature, 2020 Welch et al., Nature Medicine, 2022 基于CRISPR与微流控结合，实现超多重检测 第20页 CRISPR诊断结果的判读标准：荧光、胶体金、电化学、显色？ qPCR——Ct value LAMP/RPA——Tt value CRISPR+LAMP/RPA——Tt value endpoint value终点法 FC ratio FCration (SENA) Ct (CRISPR-TB) 是否可以用At value (angle)？ 阴性At=0；最高值At=90 肉眼观察 如何定量？ 第21页 CRISPR体系的标准化 现有的科研论文（诊断产品），都是用Cas蛋白的浓度单位：ng或pmol，而不是活力单位。 浓度单位会造成不同体系之间的结果不可重复，同一体系也会因为使用不同批次/不同厂家的酶而导致不稳定，或实验结果不可重复。 Tolo提供标准化Cas酶