1. CRISPR-Dx技术研究进展（共享版）

第1页 CRISPR-Dx技术研究进展 王金 wangjin@tolobio.com 吐露港生物 第2页 1.CRISPR研究背景简介 2.基于Cas9的CRISPR-Dx技术（初次登场） 3.基于Cas13的CRISPR-Dx技术 4.基于Cas12的CRISPR-Dx技术 5.CRISPR-Dx技术的产业化 第3页 1CRISPR研 究背景简介 第4页 Wright,et al. Cell.2016 Jan 14;164:29-44 spaceracquisition crRNAmaturation cleavinginvadingDNA CRISPR是微生物的“免疫系统” Jinek, etal.Science.2012 Aug 17;337(6096):816-21. 第5页 CRISPR-Cas蛋白的分类 Kira S. Makarovaetal.,Nat Rev Microbiol.2020 Feb;18(2):67-83 第6页 CRISPR技术的应用领域 CasProtein deadCasProtein Wang, et al. 2016;Gootenberg,etal.2017 CRISPR-Dx 第7页 磷酸酶基因编码区下游存在一段由29bp-Repeats和 32-33bp-Spacers间隔相连的重复序列。 在E.coli中首次发现有规律的重复序列 在嗜盐古菌中发现类似重复序列，并命名CRISPR 发现CRISPR在细菌和古菌中广泛存在 提出CRISPR系统的免疫功能假说2005 证实CRISPR系统的免疫功能假说 解析了Cas9作用机制，并提出基因编辑应用前景 仅解析了Cas9作用机制 将CRISPR系统应用于哺乳动物细胞编辑 开发CRISPR转录调控系统 CRISPR基因编辑发明获得诺贝尔化学奖 YoshizumiIshino Francisco Mojica Francisco Mojica Francisco Mojica Philippe Horvath E.Charpentier JenniferDoudna VirginijusSiksnys FengZhang LeiQi E.Charpentier JenniferDoudna Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats 第8页 CRISPR研究历史中的Hero（The Heroes of CRISPR ） EricLander,Cell. 2016 Jan 14;164(1-2):18-28. •Francisco Mojica •Gilles Vergnaud •Philippe Horvath •John van der Oost •Luciano Marraffini •Emmanuelle Charpentier •VirginijusSiksnys •Jennifer Doudna •Feng Zhang •George Church 第9页 Heidi Ledford,Nature. 2016July20,535:342-344. 第10页 CRISPR技术获得2020诺贝尔奖 To p 1 0 B re a k t h ro u g h of t h e y e a r 2013,2015,2017byScience “基因魔剪、上帝的手术刀” 第11页 2基于Cas9的 CRISPR-Dx技 术（初次登场） 第12页 Pardee et al., 2016, Cell165, 1255–1266 •Cas9选择性切割特定序列 •signal-OFF模式 第13页 §样本收集——RNA提取——RNA扩增——To e h o l d反应（产生信号，颜色反应：LacZ） 第14页 RNAtarget——NASBA ——RNAamplification ——Toeholdreaction Toehold体系建立： 第15页 （样本验证Toehold体系） 第16页 （NASBACC体系建立） 第17页 （NASBACC临床样本验证） 第18页 NASBACC工作的意义： 1.第一次将CRISPR技术引入体外诊断/核酸检测； 2.将NASBA恒温扩增技术与Cas9联用，进行靶标核酸的富集和序列区分（SNP）：Cas9特异识 别+精准切割。 3.引用Toehold反应，借助显色反应摆脱对检测设备的依赖，可裸眼观测或借助简单的检测设备 （Our application is easy to use, relying on a colorimetric output that can be read by the naked eye or with a low- cost, battery-operated companion reader），文中作者也开发了检测设备。 4.相比于LAMP/RPA/RCA/TMA/NASBA/SDA/HCR等恒温扩增技术，NASBACC的突破点：可 区分单碱基差异。 5.NASBACC是Signal-OFF模型（特异识别靶标序列后，切断，不产生可观测颜色） 第19页 ACS Synth Biol.2017 Feb 17;6(2):211-216.Epub2016 Oct 11（Paired dCas9 (PC) reporter system ） 第20页 第21页 PC系统： 1.第一个dCas9系统：特异识别靶标 序列，提升检测特异性。 2.需要pre-PCR，限制了应用。 3.是否可以结合恒温扩增开发一管法 体系？ 4.是否可以利用耐高温dCas9开发一 管法诊断体系？ 第22页 利用dCas9特异识别和捕获靶标核酸序列。 第23页 利用nCas9特异识别和产生nick位点，结合SDA进行靶标核酸扩增 NATURE COMMUNICATIONS | (2018)9:5012 第24页 第25页 •利用hyperthermophilic •Cas9，切割16srDNA序 列，富集靶标序列。 •类似的方法是否可用于稀 有突变的检测？ 第26页 1.特异富集靶标序列——建库——测序 2.近期有不少工作发表：是否可以用Cas12a？ 切割后产生8nt的粘性末端，直接跟 adaptor进行连接。 (Lei,etal.,NAR,2017,CCTL方法) 第27页 mSystems.2025 Feb 18;10(2):e0141324. 第28页 mSystems.2025 Feb 18;10(2):e0141324. 第29页 Kiana Aran团队2019发表 Kiana Aran团队2021发表 第30页 （2019年，建立了基于dCas9-gFET平台的靶标核酸免扩增直检技术：CRISPR-CHIP） 第31页 （2021年，在CRISPR-CHIP基础上进一步建立了SNP-CHIP） 第32页 Cas9的反式切割活性 •Cas9可以被靶标ssDNA，dsDNA，ssRNA激活反式 切割活性； •Cas9反式切割活性依赖crRNA/tracrRNA； •Cas9反式切割T/C-richssDNA，效率高于ssRNA； •基于Cas9开发了DACD和RACD核酸检测系统。 第33页 总结： 1.Cas9特异识别、切割靶标核酸序列，区分SNP，可以结合Toehold反应（2016,Cell），可 以消减非目标序列（2019,PNAS，消除16rDNA），可以筛选特定靶标序列进行建库 （2020,NBT）； 2.dCas9特异识别靶标核酸序列，直接产生信号（2017，ACSSynthBiol，PC方法），或用 于靶标核酸序列富集（2017，BB）； 3.nCas9可以特异识别靶标核酸序列，切割其中一条序列，产生nickingsite，结合SDA等方法 进行靶标核酸序列的扩增，富集（2018，NC，CRISDA方法）； 4.dCas9（CRISPR-CHIP），Cas9/dCas9-basedSNP-CHIP，和基于石墨烯的场效应晶体 管（FET）结合，实现靶标核酸免扩增直检，快检。 5.Cas9的反式切割活性，跟Cas12相比，有何技术原理上的优劣势？ 6.invivo检测？Genomicimaging？ 第34页 3基于Cas13的 CRISPR-Dx 技术 第35页 2 March 2016; accepted 25 May 2016 Published online 2 June 2016 10.1126/science.aaf5573 鉴定了C2c2（Cas13a），提出了PFS概念， 发现了旁路切割活性 Cas13旁路切割活性的发现 第36页 Cas13旁路切割活性的发现 Received 14 June; accepted 24 August 2016. Published online 26 September; corrected online 12 October 2016 鉴定了LbuC2c2（Cas13a），发现了旁路（反式）切割 活性 首次提出了将Cas13a反式切割活性用于靶标核酸检测 ToloBio#32134 LbuCas13a (C2c2) Nuclease 第37页 SHERLOCK：基于Cas13的CRISPR诊断系统 •首次将CRISPR-Cas13a反式切割活性和恒温扩增联用，开发了SHERLOCK体系，开创了CRISPR-Dx新的时代！ 第38页 SHERLOCK：基于Cas13的CRISPR诊断系统 •DNA/RNA——恒温扩增——体外转录——Cas13a反式切割——释放信号 ToloBio#32117 LwaCas13a (C2c2) Nuclease 第39页 SHERLOCK：基于Cas13的CRISPR诊断系统 Nat Protoc. 2019October ; 14(10): 2986–3012. 第40页 HUDSON：基于SHERLOCK的CRISPR诊断技术 •HUDSON (heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases) Science360, 444–448 (2018) 第41页 SHERLOCKv2：首个一管多重CRISPR诊断系统 •首次将CRISPR-Cas13a/Cas12a组合，开发了SHERLOCKv2体系； •首次将Csm6应用于CRISPR诊断以提升检测灵敏度； •将CRISPR诊断技术与LFA和显色法等技术结合； •基于多Cas酶、多gRNA、多探针的体系，太复杂，应用前景不明朗。 第42页 SHERLOCKv2：首个一管多重CRISPR诊断系统 •筛选不同物种Cas13a的特异性探针：预示着Cas13a的旁路切割活性，既随机，也有一些差异！ 第43页 SHERLOCKv2：首个一管多重CRISPR诊断系统 •SHERLOCKv2的难点除了体系复杂外，multiplexedRPA也是难点！ 第44页 SHERLOCKv2：首个一管多重CRISPR诊断系统 •SHERLOCKv2首次引入了Csm6，做信号二次放大，提升检测灵敏度 第45页 •Csm6is activated by cyclic adenylate molecules or linear adenine homopolymers terminated with a 2′,3′-cyclic phosphate （Naturevolume548,pages543–548 (2017)） (Science,2017,357(6351):605-609)Martin Jinek团队 VirginijusSiksnys团队 第46页 JenniferFIND-IT工作：Cas13+Csm6+多个crRNA This Fast Integrated Nuclease Detection In Tandem (FIND-IT) approach enables sensitive, direct RNA detection in a format that is amenable to point-of-care infection diagnosis as well as to a wide range of other diagnostic or research applications. (Nat Chem Biol.2021 Sep;17(9):982-988.) 第47页 SHERLOCKv2：首个一管多重CRISPR诊断系统 Milenia •CRISPR诊断试纸条常用的探针： FAM-Biotin标记； •C/T线与传统的扩增产物的检测 原理相反，CRISPR是C线在前； •To l o B i o提供同款胶体金试纸条。 ToloBio #31203 第48页 SHERLOCKv2：首个一管多重CRISPR诊断系统 •SHERLOCKv2开启了特异性reporter探针的筛选工作，揭示了不同Cas13蛋白反式切割的序列偏好性 第49页 SHERLOCKv2：首个一管多重CRISPR诊断系统 Liet al.,TrendsBiotech,2022 SHERLOCKv2体系开创性地引入了显色反应！ 第50页 CARMEN：多重CRISPR诊断系统 •超多重PCR •超多重CRISPR •直接对标tNGS •灵敏/特异/快/低成本 •也可以用Cas12！ 第51页 mCARMEN：多重CRISPR诊断系统 •使用了StandardBioTools（Fluidigm）芯片 •联合Cas12/Cas13实现双重 第52页 qCARMEN：多重CRISPR定量系统 •synthetic HPRT1 RNA（外参） •2023年发表于预印本 •开辟了一个潜在的新应用方向： 超多基因转录水平的定量；或靶 标DNA定量？ 第53页 基于Cas13的RNA免扩增直检：分子诊断的终极目标 Cell.2021 Jan 21;184(2):323-333.e9 第54页 4基于Cas12的 CRISPR-Dx 技术 第55页 Nuc RuvC PI WED REC1 REC2 BH TS NTS crRNA -2 6 15 30 60 Time (min) -2 6 15 30 60 M Time (min) 5′ products of ciscleavage 5′ target-DNMT1-3 (3′-FAM-labeled) substrate products of transcleavage target-DNMT1-3 (5′-FAM-labeled) ciscleavage transcleavage 30 nt20 nt 30 nt20 nt 5′ crRNA target ssDNA 5′ 5′ cis cleavage 5′ incomplete trans cleavage Nuc RuvC PI WED REC1 REC2 BH crRNA FnCas12aFnCas12a -D917A FnCas12a -E1006A FnCas12a -D1255A FnCas12a -R1218A M target-DNMT1-3 5′ Cas12a/crRNA-T1 /target-T1(ssDNA)(collateral ssDNA) no Cas12a 24nt 42nt 38nt 34nt32nt 28nt 22nt 17nt 49nt 10nt 5nt products of trans cleavage substrate products of trans cleavage (incomplete cleavage) Liet al.,CellRes,2018 Cas12反式切割活性的发现过程 第56页 amplification Cas12a reaction sample PAM fluorescence target DNA +Cas12a, crRNA,ssDNA probe ternary complex trans-cleave 15-45min 15min Liet al.,CellDis,2018 5- HOLMES:one-HOurLow-cost Multipurpose highly Efficient System 如果靶标序列存在， Cas12则可以形成三元复合物， 三元复合物被激发出反式切割活性， 切割ssDNA报告探针，释放荧光信号！ HOLMESTM系统的发明 第57页 Cas12a反式切割活性发现及DETECTR发明 DETECTR技术与HOLMES原理完全一致！ 第58页 Cas12a与智慧材料的结合 English et al., Science365, 780–785 (2019) •来自JamesCollins团队的开创性工作：microfluidic paper-based analytical devices (μPADs) ，也被用 于可穿戴设备上。 第59页 Cas12a与合成生物学的结合：可穿戴设备的开发 （Toehold） （Toehold） （Cas12afluorescence） （Cas12aμPAD） Nat Biotechnol.2021 Nov;39(11):1366-1374. 第60页 Liet al.,ACSSynthBiol.,2019 HOLMESv2：基于Cas12b的首个一步法系统 •BothDNA&RNAtargets •One-step •quantitation •SNP •DNAmethylation •ToloBio# 32116 AacCas12b (C2c1) Nuclease •ToloBio# 32118 AapCas12b (C2c1) Nuclease 第61页 张锋团队，N EnglJ Med,2020 CDetection&STOPCovid系统 第62页 Cas14-DETECTR：基于Cas12f的CRISPR诊断系统 Science362, 839–842 (2018) 16 November 2018 •Cas14（Cas12f）特点：SNP区分度好，活力低； •这篇工作认为Cas12f只能识别ssDNA •ToloBio#32119 Un1Cas12f1 (Cas14a) Nuclease 第63页 •To our knowledge, functional characterization of Cas12f proteins are limited to a single protein identified from an uncultured archaeon (Un1), initially named Cas14a1 and renamed here to Un1Cas12f1, which was shown to exclusively target and cleave ssDNA in a PAM- independent manner. •ToloBio#32119 Un1Cas12f1 (Cas14a) Nuclease Cas12f可以切割dsDNA，依赖PAM 第64页 Cas12a2可以切割dsDNA，依赖PAM AfterrecognizinganRNAtargetwithan activating PFS, Cas12a2 efficiently degradesssRNA,ssDNAanddsDNA. OurstructuresrevealthatCas12a2isautoinhibiteduntil bindingacognateRNAtarget,whichexposestheRuvC activesitewithinalarge,positivelychargedcleft. ToloBio#32122 SuCas12a2 Nuclease 第65页 Cas12家族蛋白种类多 第66页 5CRISPR诊断 技术的产业化 第67页 2017-2020 CRISPR诊断产业化：Sherlock获全球首张证 SherlockBio的第一张证开启了CRISPR诊断产业化时代！ 第68页 CRISPR诊断产业化：Mammoth获新冠EUA证 第69页 CRISPR诊断产业化：国内获两张证 杭州众测： RAA+Cas13+LFA 上海伯杰（获To l o B i o专利授权）： RPA+Cas12aFluorescentreporter 第70页 CRISPR诊断产业化困局？ProofDx被Ginkgo收购 Proof's libraries of OMEGA (Obligate Mobile Element Guided Activity) RNA programmable, non-Cas enzymes and associated intellectual property are the key focus of Ginkgo's acquisition. 第71页 CRISPR诊断产业化困局？SherlockBio被OraSure收购 第72页 CRISPR诊断何去何从？ToloBio坚定推动CRISPR-Dx产业化！ 第73页 CRISPR诊断技术成熟曲线 （Proof/Sherlock被收购） CRISPR-Dxishere! 第74页 (1983PCR-1993qPCR) PCR（灵敏、精准） (1990sMPSS-2004SBS) NGS（通量、成本） (2016trans-cleavage-) CRISPR（简便、快速） 客观看待：为什么CRISPR是下一代诊断技术？ 第75页 74Cas原料 CRISPR诊断产业化离不开Cas酶活力的标准化 第76页 CRISPR诊断产业化离不开底层专利 • 底层方法学专利： 吐露港生物，Sherlock Bio分别持有Cas12和 Cas13诊断的方法学专利；吐露港和Sherlock Bio签署了全球范围内的专利交叉授权合作协议！ 在CRISPR诊断领域，中国从一开始就站在制高点和领 跑线上！ ,'! '



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 ',-,',' 第77页 CRISPR-Dx亟需解决的技术难题：需要大家共同努力推进！ 1.CRISPR一管法/一锅法/一步法技术的不断完善； 2.CRISPR一管多重技术的建立和不断完善； 3.CRISPR免扩增直检技术的建立和不断完善； 4.CRISPR精准定量技术的建立（qCRISPR能否达到qPCR的水平？）； 5.PAM/PFS-freeCRISPR诊断技术——实现对任意位点的检测； 6.适用于CRISPR诊断技术的POCT设备平台； 7.CRISPR诊断技术的适用场景的挖掘（特异、便捷、快速）； 8.CRISPR非核酸靶标技术体系的开发； 9.…… 第78页 CRISPR诊断领域的第一本书！ 第79页 CRISPR新品预报 1.CRISPRreporter探针（适合CRISPR诊断多重）； 2.多款CRISPRCas蛋白，高特异，高性能Cas12/Cas13； 3.…… 第80页 第81页 •50度，酶/Buffer分开 •通用型 •5-15min •1-6片段（基础款） •37度，2xMix通用型 •5-15min •1-15片段 •50度，2xMix通用型 •5-15min •1-15片段 •60度，2xMix通用型 •1min •1-15片段 ToloEzMax无缝拼接（无缝克隆）试剂盒 #24303 #24305 #24317 #24321 第82页 •克隆：1min同源重组反应#24321 •转化：45S热激 •涂板：免复苏 Tolo开启5min克隆时代！ 第83页 关注我们， 了解更多进展！ ToloBio微信公众号 4.20号之后，通过添加 技术支持，加入交流群！ 加入本群，交流 CRISPR诊断技术！